乌桕δ_羟基赖氨酸的鉴别及其含量测定.PDF
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2006年2月23日
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收稿日期: 2004212221 通讯联系人: 霍光华
基金项目: 江西省教育厅资助项目
第 21 卷第 3 期 Vol . 21 No. 3
分 析 科 学 学 报 JOURNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE
2005 年 6 月 J une 2005
文章编号:100626144 (2005) 0320307203
乌桕δ 2羟基赖氨酸的鉴别及其含量测定
霍光华3 1
, 李 艳2
, 郭成志1
(1.江西农业大学分析测试中心; 2.江西农业大学成人教育学院 , 南昌 330045)
摘 要:本文报道采用溶剂提取和色谱法分离乌桕特殊氨基酸,然后利用保留时间、 已知
物峰高增加和核磁共振波谱法定性,并设计氨基酸离子交换色谱短程序定量测定乌桕特
殊氨基酸。结果证明,乌桕中存在的特殊氨基酸为δ 2羟基赖氨酸,而且是乌桕的一种非常
见蛋白氨基酸。
关键词:乌桕;δ 2羟基赖氨酸;鉴别和定量
中图分类号:O657. 7 ; Q517 文献标识码:A
植物特殊氨基酸或参与功能蛋白组成 ,或作为氮营养的吸收和转运形式 ,或起自身免疫作用等 ,其种
类、 结构、 功能甚为复杂[1 ,2 ]。乌桕( S a pi um sebi f erum (L . ) Roxb)叶具有杀虫、 抗病等活性 ,乌桕及其近
缘种化学成分研究一直受到关注[3 - 6 ]
,而其特殊氨基酸δ 2羟基赖氨酸(δ 2Hydroxylysine ,δ 2Hylys)成分至
今尚未见报道。
本文利用溶剂提取 ,色谱分离 ,采用保留时间、 已知物峰高增加和磁共振波谱定性 ,离子交换色谱定量
测定了乌桕叶中的特殊氨基酸。
1 实验部分
1. 1 仪器和试剂
日本 Hitachi 835250 型高速氨基酸自动分析仪;瑞士Bruker AV400 核磁共振波谱仪。
离子交换树脂 2619F ,B 型生理体液氨基酸 ,均为 Hitachi 公司产; 18 种混合氨基酸为 Sigma 公司
产;重水(D2O) ,北京化工厂产;其它试剂均为分析纯试剂。层析用纸为新华 3 号层析纸。
1. 2 材料
乌桕各品种叶:赣 4 鸡爪桕、 小粒鸡爪桕、 广西大粒鸡爪桕、 广西疏果桕、 分水葡萄桕、 广西蜈蚣桕、 大
粒葡萄桕、 赣2 狗尾桕、 红叶桕、 玉山大粒铜锤桕、 赣 1 铜锤桕、 云南铜锤桕、 浙江铜锤桕、 赣 3 长穗葡萄桕、寿桃桕、 广西棒槌桕等叶均采自江西省广丰县乌桕种植基地;无籽鸡爪桕叶和结籽鸡爪桕叶(简称 SsL)采
自江西农业大学校园。各乌桕叶均除湿风干 ,硅胶干燥器中贮存备用。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 氨基酸的测定 乌桕叶游离氨基酸和水解蛋白氨基酸的测定参照文献[ 2 ,7 ]进行。
1. 3. 2 特殊氨基酸的提取、 分离 结籽鸡爪桕叶粉 →10 倍量的 70 %乙醇水溶液提取 →提取液浓缩脱醇
→ 乙醚脱脂 ,水层 → 过离子交换树脂柱 ,柠檬酸缓冲液洗脱 → 收集 Phe 和 Lys 之间馏份 →反复浓缩盐析 ,上清液→ 纸层析制备 ,展开剂为正丁醇∶ 80 %甲酸∶ 水 = 15∶ 3∶ 2 (V V ) → 氨基酸仪检测纯度 → 特殊氨基酸。
1. 3. 3 特殊氨基酸的定性鉴别 在同一柱条件(柱长、 固定相等)下 ,采用不同分析程序(72 min、 25 min)
的洗脱条件 ,比较已知物和未知物的保留值 ,以及峰叠加情况 ,初步定性。取少量分离的特殊氨基酸粉末
于核磁管中 ,加适量核磁用D2O ,核磁共振仪测定氢谱和碳谱 ,定性。
1. 3. 4 特殊氨基酸短程序定量分析 设计短程序 ,外标法测得乌桕各种质材料中特殊氨基酸的含量。
703
? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.第 3 期 霍光华等:乌桕δ 2羟基赖氨酸的鉴别及其含量测定 第 21 卷
2 结果与讨论
2. 1 乌桕叶特殊氨基酸的检识
标准蛋白氨基酸、 乌桕游离氨基酸及其提取液水解产物色谱图见图 1。由图可见:乌桕叶游离氨基酸
的色谱保留时间为31. 22 min的峰(图 1b) ,无对应蛋白氨基酸峰。将其提取液用 6 mol L 盐酸溶液水解
后测定,结果如图 1c 所示 ,该峰并未消失 ,反而有所增大。这说明乌桕叶存在一种特殊氨基酸 ,且为游离
氨基酸中的主要成分 ......
基金项目: 江西省教育厅资助项目
第 21 卷第 3 期 Vol . 21 No. 3
分 析 科 学 学 报 JOURNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE
2005 年 6 月 J une 2005
文章编号:100626144 (2005) 0320307203
乌桕δ 2羟基赖氨酸的鉴别及其含量测定
霍光华3 1
, 李 艳2
, 郭成志1
(1.江西农业大学分析测试中心; 2.江西农业大学成人教育学院 , 南昌 330045)
摘 要:本文报道采用溶剂提取和色谱法分离乌桕特殊氨基酸,然后利用保留时间、 已知
物峰高增加和核磁共振波谱法定性,并设计氨基酸离子交换色谱短程序定量测定乌桕特
殊氨基酸。结果证明,乌桕中存在的特殊氨基酸为δ 2羟基赖氨酸,而且是乌桕的一种非常
见蛋白氨基酸。
关键词:乌桕;δ 2羟基赖氨酸;鉴别和定量
中图分类号:O657. 7 ; Q517 文献标识码:A
植物特殊氨基酸或参与功能蛋白组成 ,或作为氮营养的吸收和转运形式 ,或起自身免疫作用等 ,其种
类、 结构、 功能甚为复杂[1 ,2 ]。乌桕( S a pi um sebi f erum (L . ) Roxb)叶具有杀虫、 抗病等活性 ,乌桕及其近
缘种化学成分研究一直受到关注[3 - 6 ]
,而其特殊氨基酸δ 2羟基赖氨酸(δ 2Hydroxylysine ,δ 2Hylys)成分至
今尚未见报道。
本文利用溶剂提取 ,色谱分离 ,采用保留时间、 已知物峰高增加和磁共振波谱定性 ,离子交换色谱定量
测定了乌桕叶中的特殊氨基酸。
1 实验部分
1. 1 仪器和试剂
日本 Hitachi 835250 型高速氨基酸自动分析仪;瑞士Bruker AV400 核磁共振波谱仪。
离子交换树脂 2619F ,B 型生理体液氨基酸 ,均为 Hitachi 公司产; 18 种混合氨基酸为 Sigma 公司
产;重水(D2O) ,北京化工厂产;其它试剂均为分析纯试剂。层析用纸为新华 3 号层析纸。
1. 2 材料
乌桕各品种叶:赣 4 鸡爪桕、 小粒鸡爪桕、 广西大粒鸡爪桕、 广西疏果桕、 分水葡萄桕、 广西蜈蚣桕、 大
粒葡萄桕、 赣2 狗尾桕、 红叶桕、 玉山大粒铜锤桕、 赣 1 铜锤桕、 云南铜锤桕、 浙江铜锤桕、 赣 3 长穗葡萄桕、寿桃桕、 广西棒槌桕等叶均采自江西省广丰县乌桕种植基地;无籽鸡爪桕叶和结籽鸡爪桕叶(简称 SsL)采
自江西农业大学校园。各乌桕叶均除湿风干 ,硅胶干燥器中贮存备用。
1. 3 实验方法
1. 3. 1 氨基酸的测定 乌桕叶游离氨基酸和水解蛋白氨基酸的测定参照文献[ 2 ,7 ]进行。
1. 3. 2 特殊氨基酸的提取、 分离 结籽鸡爪桕叶粉 →10 倍量的 70 %乙醇水溶液提取 →提取液浓缩脱醇
→ 乙醚脱脂 ,水层 → 过离子交换树脂柱 ,柠檬酸缓冲液洗脱 → 收集 Phe 和 Lys 之间馏份 →反复浓缩盐析 ,上清液→ 纸层析制备 ,展开剂为正丁醇∶ 80 %甲酸∶ 水 = 15∶ 3∶ 2 (V V ) → 氨基酸仪检测纯度 → 特殊氨基酸。
1. 3. 3 特殊氨基酸的定性鉴别 在同一柱条件(柱长、 固定相等)下 ,采用不同分析程序(72 min、 25 min)
的洗脱条件 ,比较已知物和未知物的保留值 ,以及峰叠加情况 ,初步定性。取少量分离的特殊氨基酸粉末
于核磁管中 ,加适量核磁用D2O ,核磁共振仪测定氢谱和碳谱 ,定性。
1. 3. 4 特殊氨基酸短程序定量分析 设计短程序 ,外标法测得乌桕各种质材料中特殊氨基酸的含量。
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? 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.第 3 期 霍光华等:乌桕δ 2羟基赖氨酸的鉴别及其含量测定 第 21 卷
2 结果与讨论
2. 1 乌桕叶特殊氨基酸的检识
标准蛋白氨基酸、 乌桕游离氨基酸及其提取液水解产物色谱图见图 1。由图可见:乌桕叶游离氨基酸
的色谱保留时间为31. 22 min的峰(图 1b) ,无对应蛋白氨基酸峰。将其提取液用 6 mol L 盐酸溶液水解
后测定,结果如图 1c 所示 ,该峰并未消失 ,反而有所增大。这说明乌桕叶存在一种特殊氨基酸 ,且为游离
氨基酸中的主要成分 ......
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